Polskie Forum Entomologiczne

Temat zasługujący na przypomnienie i polemikę, a tak rzadko poruszany na Forum. Istnieje znany wszystkim entomologom poruszającym się w strefie barwienia aparatów genitalnych, sposób z użyciem czerni chlorazolowej.
Niegdyś również opisywana metoda przez naszego Kolegę Grzegorza B., w "Poradnik Mikrolepidopterologa", J.Buszko-T.Rynarzewski. Mnie interesuje coś takiego, znajdującego się pod tym tytułem:
A new genus of primitive Nepticulidae (Lepidoptera) from eastern Australia, with a revised diagnosis of nepticulid subfamilies (link nie wchodzi)
W części Metody, można cytować dokładny opis rzadkiej techniki z użyciem kwasu mlekowego, fenolu, kwaśnej fuksyny i azofloksyny. Wszystkie składniki są dostępne w krajowych sklepach chemicznych, poza ostatnim dziwnie brzmiącym, a mianowicie - azofloksyną.
Prawdę mówiąc nikt, kogo poprosiłem o pomoc, nie potrafił określić, z czym mamy do czynienia? Przypuszczam, że autor artykułu pisał o floksynie, barwniku organicznym. Włącznie z fuksyną, mieszanina barwi na kolor czerwony.
Może znajdzie się wśród czytających chemik z wykształcenia?

adam k. pisze:Wszystkie składniki są dostępne w krajowych sklepach chemicznych, poza ostatnim dziwnie brzmiącym, a mianowicie - azofloksyną.
Prawdę mówiąc nikt, kogo poprosiłem o pomoc, nie potrafił określić, z czym mamy do czynienia?

Azophloxine, also known as acid red 1 (AR 1), is a member of synthetic red azo dye family. Azo dye is an organic dye with good photo-thermal stability, dissolvability and easy preparation feature. In addition, it also has noticeable third order nonlinearity and good optical power limiting properties. It has been used as a real acid counterstain in light and fluorescence microscopy. Azophloxine also facilitates the determination of proteins and peptides.

https://www.sigmaaldrich.com/catalog/pr ... &region=PL

Dzięki,

Utwierdzam się jeszcze bardziej, w przekonaniu o małych kompetencjach sprzedawców sklepów branżowych.

Adam, jest jeszcze metoda barwienia za pomocą Oranżu G rozpuszczonym w kwasie mlekowym. Barwi na kolor żółto-pomarańczowy. Robiłem testy tej techniki na podstawie korespondencji z J.F Landry'm i jego uwag, który stosuje tę technikę z powodzeniem od wielu lat. Wadą jest to, że preparat przechowywany w kwasie mlekowym z czasem się odbarwia a sama jakość barwienia pozostawia wiele do życzenia tzn. barwi dobrze ale jednolicie i monotonnie, w przypadku różnie zesklerotyzowanych struktur wszystko jest jednobarwne.
Tą technikę można z powodzeniem stosować w przypadku mocno "przetrawionych" KOH preparatów.

Faktycznie, po dłuższym przechowywaniu w kwasie mlekowym, obiekt staje się blady a potem "przeźroczysty". To mogę potwierdzić! .

Grzegorz, zacytowałem Cię na początku wątku. Mam publikację i również stosuję metodę z Oranżem G, mam takie same spostrzeżenia po zabarwieniu. Jest dobra, ale brakuje kontrastów na brzegach.

Po namyśle mógłbym zamówić azofloksynę, tylko ilość 25g dla mnie , to zbyt wiele. Może znajdzie się chętny na 1/2, itp.?
Info na pocztę - zapraszam.

Adam, może napisz co chcesz osiągnąć tą techniką, dlaczego szukasz czegoś innego niż powszechnie stosowane metody ?
Wątek po rozwinięciu może być interesujący...

Grzegorz Banasiak pisze:Adam, może napisz co chcesz osiągnąć tą techniką, dlaczego szukasz czegoś innego niż powszechnie stosowane metody ?
Wątek po rozwinięciu może być interesujący...

Zawsze w poszukiwaniach czegoś nowego, towarzyszy przekonanie, że nowe będzie lepsze (wydajniejsze, precyzyjniejsze, sprawniejsze, itp.). W tym przypadku mam nadzieję osiągnąć lepszy efekt optyczny podczas oglądania małych struktur chitynowych, wyodrębnić nakładające się na siebie, mało widoczne i niekontrastowe brzegi. Jest to niezbędne w pracy nad aparatami kopulacyjnymi małych motyli, w takich nadrodzinach jak np.: Micropterigoidea, Nepticuloidea, Gelechioidea. Zajmowanie się wszystkimi grupami tych motyli na przyzwoitym poziomie, to zajęcie dla profesjonalistów. Posiadając materiał nieoznaczony często kontaktujemy się ze specjalistami, przesyłając zdjęcia do weryfikacji gatunku. Dlatego staram się, aby ich jakość była przyzwoita. Piszesz o powszechnie stosowanych metodach, tylko gdzie? Mam wrażenie, że te powszechne, są i tak wyszukane na naszym "terenie". Sam widzisz, jakie jest zainteresowanie tym tematem, a może jest niechęć do podzielenia się wiedzą z innymi? Do tej pory znalazło się zaledwie trzech rozmówców, albo jest to tajemna wiedza w entomologii, a może coś innego? Przeglądając liczne publikacje obce (już o tym kiedyś pisałem), widzimy całe zgrupowania gatunków "obrobionych" tą rzadką techniką barwienia. Jeżeli byłaby zbędna, zbyt wyszukana, nieprzydatna, nikt nie sięgałby po nią.
Udzieliłem chyba więcej odpowiedzi, niż zadałem pytań?

adam k. pisze:... Sam widzisz, jakie jest zainteresowanie tym tematem, a może jest niechęć do podzielenia się wiedzą z innymi?  Do tej pory znalazło się zaledwie trzech rozmówców, albo jest to tajemna wiedza w entomologii, a może coś innego?
....
Udzieliłem chyba więcej odpowiedzi, niż zadałem pytań?

Zainteresowanie jest, dla mnie właśnie tym, jaką metodą staracie się wypracować nowe techniki w preparatyce i jak to się upowszechnia. Mnie osobiście interesuje jak komunikacja wpływa na rozwój entomologii, czyli pośrednio nauki. Czytających jest znacznie więcej niż piszących, sam niejednokrotnie prowadziłem długie "dyskusje", które okazywały się monologami. To normalne, jesteś najbardziej zainteresowany tym tematem. A może nawet jesteś pionierem i nikt tu nie ma nic do dodania

W nauce obowiązuje wyścig dlatego więcej będzie zainteresowania wśród tych, którzy szukają i nie potrafią a mniej u tych, którzy to już wiedzą, doszli do tego jakąś swoją ciężką pracą (wyjazdy zagraniczne, warsztaty, sympozja) z poświęceniem sporych nakładów finansowych i czasowych. Dlatego może taka publiczna platforma nie jest dobra do dzielenia się jakimiś wyjątkowymi patentami, ale przynajmniej jest dobra do zadawania pytań. Może na początek warto dowiedzieć się czyli poprosić o kontakt osoby które miały do czynienia z tą techniką a potem już to pociągnąć na priva. No i czasu trzeba, nie wszyscy codziennie tu zaglądają. Trzymam kciuki za rozwój metod.

... zgadza się. Od wielu lat zajmuję się mikrusami i znam ten ból. Przeszedłem już ten etap z barwieniem. O ile z preparatyką miałem łatwiej bo indywidualnie pokierował mną jeden z znanych na forum Profesorów, jeden dzień wspólnej pracy posunął mnie z umiejętnościami i wiedzą o dziesięć lat do przodu, o tyle umiejętność barwienia nie przyszła już tak łatwo.
Całościowy temat preparatyki i barwienia genitaliów Microlepidoptera przygotowujemy do publikacji (na pewno się z tym jeszcze zejdzie bo to część większej całości) i nie chciałbym tutaj tego w pełni opisywać ale jeśli potrzebujesz pomocy pisz śmiało.

Generalnie przy mikrusach ważne jest odpowiednie "gotowanie" i w zależności od jego efektów dobiera się metodę barwienia. Bardzo istotna jest umiejętność odpowiedniego "gotowania", okaz nie może być zbyt mocno potraktowany ługiem ani zbyt słabo. Znalezienie optymalnego czasu nie jest łatwe i zależy od wielu czynników. Większość gotuje "na oko" i efekty bywają różne. Z drugiej strony samo barwienie jest mniej istotne do oznaczania a bardziej do przygotowania preparatów do fotografowania. Ja czasem dostaję prepaty które będąc niedostatecznie wypłukane "trawią" się KOH dalej, w rezultacie są mocno przezroczyste i czasem trudno je w glicerynie znaleźć. Wtedy Oranż G jest niezastąpiony jednak zawsze błoniaste struktury barwię czernią chlorazolową (bardzo słaby rozstwór) i proces barwienia kontroluję cały czas pod mikroskopem.

Ważne jest też czy dalej przechowujesz preparat w glicerynie czy robisz preparat stały na szkiełku. Jeśli stały to zdecydowanie w euparalu (niemieckim, jego jakość u różnych producentów bywa różna) i tu też jest wiele kruczków związanych z rozkładaniem i odpowietrzaniem. Jeśli w glicerynie to ok. 70%, stosowanie bardziej stężonej mocno odwadnia i usztywnia obiekt czyniąc go w przysżłości kruchym i łatwym do uszkodzenia.

A tak przy okazji tego wątku, choć to nie będzie zbyt duży offtop, naszło mnie takie skojarzenie.

Czy takie słabo wybarwione preparaty nie dałoby się obejrzeć w innej technice obserwacji - ciemne pole / kontrast fazowy, gdzie często barwienie nie jest konieczne? Być może te struktury, normalnie słabo widoczne, byłyby zdecydowanie lepiej uwidocznione.

Oczywiście zdaję sobie sprawę, że KF nie jest tanią techniką, ale może ktoś dysponuje mikroskopem z takim rozwiązaniem na uczelni? Ciemne pole, można od biedy "zasymulować", wprowadzając odpowiedniej wielkości czarny krążek w kondensor lub ew. kładąc go na soczewce kolektora mikroskopu.

Być może ciut prościej i z większą gwarancją powtarzalności dałoby zapewnienie odpowiedniego układu optycznnego niż kombinowanie z bardzo wyrafinowanymi metodami preparatyki.

Poniżej zestawienie niebarwionej tkanki zwierzęcej w trzech technikach. Klasyczne jasne pole, kontrast fazowy i ciemne pole.

Jacek Kurzawa pisze:

adam k. pisze:... Sam widzisz, jakie jest zainteresowanie tym tematem, a może jest niechęć do podzielenia się wiedzą z innymi?  Do tej pory znalazło się zaledwie trzech rozmówców, albo jest to tajemna wiedza w entomologii, a może coś innego?
....
Udzieliłem chyba więcej odpowiedzi, niż zadałem pytań?

To normalne, jesteś najbardziej zainteresowany tym tematem. A może nawet jesteś pionierem i nikt tu nie ma nic do dodania

.

Jacku, tylko tą część chciałem skomentować.
Ciekawość moja była skierowana, na dowiedzenie się, czy ktoś wie więcej na temat związku chemicznego, a jeszcze przy okazji czy stosował ktoś tą technikę barwienia?
Obecnie nie zamierzam niczego odkrywać, chcę spróbować tej "wyszukanej techniki"
Gotowanie, przetrzymywanie w ługach i inne, to raczej dla adeptów preparatyki.
Prosiłem o kontakt na priva, ale nadal nic w tym temacie, "Może nikt nie ma nic do dodania"? Za to otrzymałem wyczerpującą odpowiedź od specjalisty spoza kraju, (12 godziny oczekiwania).

Osób zajmujących się tym jest w Polsce niewiele, kilka. Widocznie jeszcze ta właściwa osoba jeszcze tego nie przeczytała. Spokojnie.

Pierwsze próby z mieszaniną opisaną wcześniej mam już za sobą. Jest dobrze, ale powinno być lepiej w przypadku barwienia najdrobniejszych struktur aparatów kopulacyjnych.
Na pierwszym zdjęciu widać, że barwnik wnika również w chitynę. W czasie zaledwie kilku prób zauważyłem odwracalność procesu barwienia. Opisywana w artykule o Nepticulidae metoda wymaga jednak poświęcenia znacznie więcej czasu, niż przypuszczałem na początku tej drogi.

Kolejna próba z mieszaniną o innym składzie dała nieoczekiwany efekt. Zaledwie po 90-ciu minutach barwienia chityna stała się ciemna, a najcieńsze struktury edeagus zabarwiły się na tzw. buraczkowy . Kolorystyka preparatu aparatu kopulacyjnego Oxyptilus distans (ZELLER, 1847) zamkniętego w euparalu jest oryginalna, nie zmieniałem nasycenia podczas delikatnej obróbki tła zdjęć.

Poprzedni preparat Yponomeuta cagnagella, po upływie paru dni wyraźnie rozjaśniał.

No teraz efekt jest zachęcający i zdecydowanie lepszy, znacznie lepiej niż na poprzednim zdjęciu i bardziej naturalnie.
Podobne efekty można uzyskać barwiąc oranżem G w kwasie mlekowym ale trwałość barwienia jest dość słaba.