Trochę się ten temat "uleżał", a ja potrzebowałem akurat więcej czasu, by dopracować odpowiednio tekst o metodyce, bo taki w szczególności powinien być dopracowany. Ale aktualności nie stracił, więc w końcu go zamieszczam z nadzieją, że na coś się przyda.
Grzegorzu, po pierwsze i najważniejsze cieszę się, że szpital stracił już zainteresowanie Twoją osobą. Mogę zatem ze spokojnym sumieniem trochę cię podenerwować
Jesteś niewątpliwie perfekcjonistą. Ale gdybym miał czekać na możliwość oznaczenia okazu tyle, co Ty przez tą rozbudowaną i bezkompromisową preparatykę, szybko bym się zniechęcił do entomologii. Nie mam tyle wolnego czasu, ani cierpliwości
Adam wielokrotnie prezentował na tym forum zdjęcia swoich preparatów motyli, którym moim zdaniem nic nie brakuje (no może niekiedy są przebarwione), więc jeśli nawet robi preparaty trochę inaczej, to robi je nie gorzej od ciebie. Dobrze, że te nieporozumienia zostały już wyjaśnione. Metody każdy, na bazie ogólnego schematu i ew. nauk i szkoleń od bardziej doświadczonych nauczycieli, wypracowuje i modyfikuje w szczegółach z czasem sam, dostosowując do swoich potrzeb i możliwości – czasowych, technicznych i finansowych.
Porównując swoją metodykę z twoim opisem Grzegorzu, jestem po wielokroć ignorantem, i to leniwym. Nie mam więc za bardzo czego reklamować, ale skoro pojawiło się pytanie o przydatność twoich metod do preparowania genitaliów Coleoptera, i uznałeś je w sumie za nieprzydatne, to może jednak napiszę jak ja to robię, bo może ktoś znajdzie w tym jakąś przydatną wskazówkę. Wbrew pozorom wygląda to bardzo podobnie, a różnice dotyczą raczej szczegółów, a nie ogólnych zasad. Z zastrzeżeniem, że jednak preparaty chrząszczy wyglądają na „łatwiejsze” niż motyli, a przynajmniej więcej brutalnego traktowania i błędów wybaczają, ze względu na dużo większy udział elementów zesklerotyzowanych i faktycznie sztywnych. Już to, że w wielu rodzinach Coleoptera standardem jest zwykłe naklejenie wyciągniętego fiutka na kartonik obok okazu, bo liczy się praktycznie tylko kształt, a nie jakieś subtelne struktury w środku, wiele tłumaczy. Zatem opiszę pokrótce, jak to u mnie wygląda od lat prawie 20. Wcześniej robiłem klasyczne preparaty w balsamie kanadyjskim, bardziej skomplikowane i czasochłonne przez 2-3 stopniowe odwadnianie. Ale mi się znudziło, no i ksylen przestał mi się podobać...
1. KOH używam w płatkach, wysypuję kilka na oko na rękę (koniecznie suchą!) i wrzucam do naczyńka (chyba ok. 5 ml) , odpowiednio szerokiego, by można było w nim swobodnie manipulować pęsetą czy zakrzywioną szpilką, po czym zalewam do 2/3 wysokości H2O destylowaną. Stężenie więc nieznane (kiedyś recenzent jakiegoś mojego maszynopisu dopominał się wpisania tego w metodyce, to go wyśmiałem), ale raczej spore, na pewno >10%). Z czasem nauczyłem się używać „na oko” podobnej ilości KOH, ale co z tego, skoro w trakcie długotrwałego podgrzewania przy robieniu serii preparatów poziom roztworu w naczyńku potrafi spaść o kilkaset %. Wtedy w końcu dolewam wody destylowanej.
2. Do podgrzewania używam wciąż palnika spirytusowego – obecnie z Paradoxa, bo trudno kupić gdzieś indziej coś sensownego (z racji miejsca pracy do skażonego alkoholu mam dostęp nieograniczony i bezpłatny, a ceny profesjonalnych kuchenek z regulacją grzania poniżej 100 stopni powalają) i stojaka metalowego na 3 nóżkach z metalową płytką-nakładką. Przy odpowiednio dobranych odległościach palnika od naczyńka (różne podkładki z tego co „pod ręką”) i wielkości płomienia, nie ma problemu z zagotowaniem i wypryśnięciem roztworu w naczyńku (to nie powinno się zdarzyć, bo możemy stracić preparat) oraz z bezpieczeństwem (jak zapomnimy albo coś innego nas zajmie, to w końcu alkohol sie wypali i płomień zgaśnie). Tylko pilnujmy, by jakieś papiery się w okolicy palnika nie pałętały, bo przeciąg albo inny przypadek z kategorii tych, co nie powinny się nigdy zdarzyć.... Wszystko, co teoretycznie może się zdarzyć, kiedyś się zdarzy.
3. Oderwany odwłok (małego) chrząszcza wrzucam do naczyńka z roztworem KOH i podgrzewam do „gorącości” przez kilka-kilkanaście minut. Wyjmuję do wody destylowanej i sprawdzam pod binokularem (oczy już nie te, co kiedyś), czy tkanki już się odpowiednio wytrawiły, i ew. dalej podgrzewam w razie potrzeby. Zwykle wystarcza kilka minut, chyba że okaz był utrwalony w stężonym alkoholu, to wtedy zwykle 2-3 x dłużej, bo mocno zdenaturowane białka dużo wolniej reagują na KOH. Zauważyłem przy tym, że pozostawiony w naczyńku roztwór KOH z poprzedniego dnia działa kilkakrotnie wolniej, nie bardzo wiadomo dlaczego, więc każdego dnia sporządzam roztwór z płatków KOH od nowa.
4. Jak już chyba kiedyś pisałem, jako narzędzi do manipulowania samym preparatem używam wyłącznie szpilek entomologicznych (od 000 do 0) trzymanych w palcach, nie uznaję tzw. igieł preparacyjnych. Oprawione jakoś minucje przydały mi się chyba tylko parę razy w życiu, przy okazji rozdzielania narządów gębowych małych ryjkowców, a nie genitaliów. W wielu sytuacjach przydaje się cienka szpilka z haczykowato zakrzywionym czubkiem i warto sobie kilka takich zrobić i trzymać pod ręką. Odpowiednią mozna uzyskać za którymś razem pukając czubkiem o płaską szklaną powierzchnię. Pęsety precyzyjne (najlepsze okazały się te proste) przydają mi się wyłącznie do przenoszenia tego, co się podgrzewa w naczyńku, na szkiełko. Skalpeli nie używam w ogóle, natomiast pędzelki służą mi wyłącznie do ewentualnego przyklejania (mieszaniną śliny z klejem) stóp i czułków okazu do kartonika, jeśli zależy mi, by był spreparowany „wystawowo” albo do zdjęcia „paszportowego”
. Nigdy mi nawet do głowy nie przyszło, by używać ich podczas preparatyki genitalnej. Miedzy szkiełkami przenoszę preparaty albo jego elementy już tylko na czubku szpilki trzymanej w palcach. Gliceryna jest lepka, więc zakrzywione szpilki przestają być do przenoszenia potrzebne, przydają się tylko do wyciągania preparatu albo jego fragmentów z wody lub roztworu KOH.
4. Odwłok jest wyławiany zakrzywiona szpilką lub ostrą pęsetą z KOH do H2O destylowanej w naczyńku preparacyjnym (szklana kostka z zagłębieniem, nie wiem jaką to ma polską nazwę i czy w ogóle ma) i w ten sposób płukany chwilę z KOH, po czym przenoszony na szkiełko podstawowe z łezką do kropli H2O destylowanej.
5. Przy tym przeniesieniu występuje znaczna różnica osmotyczna między stężonym roztworem KOH a H2O destylowaną i nierzadko zdarza się osmotyczne napięcie błoniastych struktur takich jak endofallus czy bursa copulatrix. Jeśli coś takiego widzę i jest to dla mnie ważne i warte zarejestrowania, np. do opisu gatunku, to fotografuję to z wody (na szczęście mam czym i stoi pod ręką – wystarczy przejść parę kroków ze szkiełkiem w ręku), bo po przeniesieniu do gliceryny napięta błoniasta struktura (spermateka, bursa, endofallus) nieuchronnie się zapadnie i zniekształci, zwykle bezpowrotnie.
6. Po ew. sfotografowaniu w wodzie, preparat przenoszę szpilką do przygotowanej wcześniej kropli glicerynowego roztworu czerni chlorazolowej. Na jedną do kilku minut, zależy to głównie od wielkości okazu i proporcjonalnej do tego grubości błony genitalnej. Naprawdę cienkich błon praktycznie nie sposób przebarwić, problem może wystąpić tylko przy większych okazach i grubszych błonach i tu trzeba bardzo uważać z czasem barwienia, niekiedy wystarczy mniej niż minuta. U chrząszczy większe okazy zaczynają się w tym kontekście od 8-10 mm, więc nie muszę uważać zbyt często, a preparując w ten sposób głównie Apionidae prawie wcale
7. Nie jest prawdą Grzegorzu, że chlorazol tak źle rozpuszcza się w glicerynie, to co piszesz, to jakiś absurd. Swoje roztwory chlorazolu w glicerynie od lat sporządzam w ten sposób, że nabieram odrobinę czerni na ostry czubek cienkiej szpilki entomologicznej (naprawdę trzeba uważać z ilością!) i wprowadzam do 1-2 kropli gliceryny na szkiełku z łezką, mieszając trochę mechanicznie szpilką po paru minutach, bo kryształki rozpuszczają się „w oczach”. Już na drugi dzień mam gotowy i jednorodny roztwór do barwienia, nawet bez dodatkowego mieszania. Zwykle wychodzi nam wtedy roztwór ciemny i to jest kwestia wprawy i wyczucia, ile tego chlorazolu damy, by w roztworze dało się dostrzec nasz wrzucony w celu wybarwienia preparat. Ale po paru-parunastu próbach będziemy już wiedzieli ile czerni dać, by nie przesadzić i nie otrzymać czarnej otchłani, w której „ginie” wszystko, co się tam wrzuci. Oczywiście w tej metodzie nie ma Grzegorzu w ogóle mowy o jakichś określonych stężeniach barwnika, ani tym bardziej możliwości bieżącej kontroli stopnia wybarwienia, ale uważam to za zbytek łaski i stratę czasu. Szczęśliwie u chrząszczy można sobie to z powodzeniem podarować, a przypuszczam, że u większości motyli też. Preparuję sporo samic ryjkowców, również o wielkości ciała rzędu 1.0-1.5 mm, gdzie niewiele jest zesklerotyzowanych elementów, podobnie albo nawet mniej niż u Microlepidoptera. Takie szkiełko z tym samym glicerynowym roztworem chlorazolu służy mi do barwienia kolejnych preparatów przez nawet kilka tygodni. Przenosząc preparaty z wody stopniowo ten glicerynowy roztwór czerni rozcieńczam, ale póki nie zacznie mi spływać ze szkiełka, nie ma to większego znaczenia i nawet wiele to nie zmienia (chlorazol w wodzie barwi szybciej niż w glicerynie, więc nawet gdy chodzi o tempo barwienia, wychodzi na jedno). Ważne tylko by chronić szkiełko z roztworem czerni przed wszechobecnym kurzem (dla ew. potrzeb przyszłych zdjęć), radzę w tym celu trzymać takie szkiełka do barwienia stale pod szczelnym przykryciem. Ja trzymam kawałki pianki z wielokrotnie używanymi szkiełkami z czernią i czystą gliceryną w przezroczystych pudełkach z pokrywką po 16 czekoladkach Ferrero Rocher. Polecam – moga mieć wiele zastosowań w entomologii, również do hodowli czy przetrzymywania „na żywo” prób przesiewek z winklerów (te pudełka to „patent” Pawła Jałoszyńskiego, nie mój). Kobiety i dzieci bardzo lubią te czekoladki, a nam zostają pudełka – same korzyści
Tylko mogłyby być tańsze....
8. Ze szkiełka z roztworem barwiącym preparat przenoszę szpilką na szkiełko z łezka wypełniona wodą destylowaną, albo do tego samego naczyńka, w którym płuczę odwłok wyciagnięty z KOH – to zależy od wielkości obiektu. Na chwilę, zwykle nawet parę razy nim wtedy potrząsam czubkiem szpilki by szybciej odpłukać nadmiar chlorazolu. Taki preparat oglądam w wodzie i sprawdzam, czy czasami nie da się zrobić lepszych zdjęć, jeśli podczas barwienia napięte struktury się nie zapadły (głównie chodzi o spermatekę i jej już wtedy wybarwiony przewód, bo bursa czy endofallus zapadają się praktycznie zawsze, chyba że barwimy je w wodnym roztworze chlorazolu albo mocno rozwodnionej glicerynie). Dla potrzeb ew. zdjęć czasami manipulacji preparatem czy usuwania przeszkadzających fragmentów błon albo tchawek dokonuję już na tym etapie, czyli jeszcze w wodzie.
9. Zazwyczaj jednak po wypłukaniu preparatu w wodzie przenoszę go szpilką na inne szkiełko z łezką, do kropli gliceryny. Tam dokonuję pod binokularem wszelkich manipulacji preparatem, rozdzielania na elementy, rozrywania wybarwionych już i dobrze widocznych błon w odpowiednich miejscach, oddzielania niepotrzebnych zazwyczaj błon i tergitów odwłoka, tchawek itd. W ten sposób, korzystając z nabytej wiedzy jak zbudowany i pofałdowany jest postabdomen, czyli wpuklony do wewnątrz koniec odwłoka z połączonymi tą samą błoną genitalną różnymi sklerytami segmentalnymi i właściwymi genitaliami, przygotowuję zestaw elementów do ewentualnych zdjęć. Albo po prostu oglądam i porównuję z innymi preparatami w celu oznaczenia gatunku. O zdjęciach tyle piszę, bo zdarza mi się dość często preparować gatunki, które trzeba nazwać i opisać, a wtedy zdjęcia są niezbędne. Jeśli dysponujemy pojedynczym takim okazem, to trzeba dochować staranności by nie popsuć preparatu i obfotografować go na każdym etapie, bo obraz napięcia różnych mniej sztywnych struktur może okazać się być nam dany tylko raz w trakcie preparacji, bynajmniej nie na jej końcu w preparacie glicerynowym.
10. Po wszystkim przenoszę wszystkie elementy szpilką do gliceryny w mikrofiolce (mniejszy rozmiar kupiony w Paradoxie – są drogie ale doskonałe, tylko trzeba opanować czynność zatykania jej korkiem - zwykle pomagam sobie szpilką wetkniętą między korek a ściankę fiolki by umozliwić odpowietrzenie) i podpinam pod okaz. Traktuję je jako preparaty trwałe, choć niektórzy ostrzegają, że gliceryna nie chroni przed pleśnieniem (niektóre muzea nie życzą sobie takich preparatów przy holotypach). Nigdy nie widziałem takiego przypadku, choć oglądałem już preparaty w fiolkach z gliceryną mające i 50 lat. Myślę, że wystarczy uważać, by nie pakować do mikrofiolki preparatów z wody i zbytnio gliceryny nie rozwadniać. No i używać w preparatyce wody destylowanej.
11. Zwyczajowo umieszczam w fiolce z gliceryną wszystkie elementy preparatu, również te, jak np. tergity odwłoka wraz z błonami czy skrzydła z tergitami i mięśniami tułowiowymi (u chrząszczy to się zdarza podczas preparowania), które wydają się na bieżąco niepotrzebne. Nigdy nie wiadomo co będzie potrzebne w przyszłości i taką zasadę polecam wszystkim. Nawet gdyby to wszystko pomieścić, potrzebna jest druga mikrofiolka z gliceryną.
12. U chrząszczy preparaty na szkiełkach przykrywane szkiełkami nakrywkowymi, nieważne w balsamie czy w euparalu, raczej nie są praktykowane. Z prostego powodu, do celów diagnostycznych penisy i tegmeny trzeba oglądać w różnych planach, przynajmniej od góry i z boku, co przykryty preparat uniemożliwia. Poza tym najczęściej edeagus u chrząszczy jest łukowato wygięty i sztywny - przykryty szkiełkiem układa się zawsze na boku. Dzięki współpracy z różnymi osobami mam też trochę doswiadczenia z preparatami w euparalu na kartonikach obok okazu, więc niczym nie przykrytymi, i to też się nie sprawdza. Euparal jest za rzadki i nie przykrywa odpowiednio wystających elementów, a dla endofallusów z jakimiś rozbudowanymi sklerytami wewnętrznymi, ta metoda powinna być wręcz zabroniona, bo głównie psuje preparat, zwykle nieodwracalnie. Nawet gdy uda nam się przełożyć taki penis do balsamu albo gliceryny by go obejrzeć w świetle przechodzącym, to zwykle kosztem nieodwracalnego zapowietrzenia endofallusa. Dobrą alternatywą są preparaty w balsamie kanadyjskim na kartonikach z przezroczystego tworzywa. Niczym nie przykrywane, by można było po 1 dniu, używając ksylenu, ustawić obiekt szpilką w pożądanej pozycji, albo ją zmienić gdy potrzebne są dwa rzuty. Tak robiłem dawno temu. Ale to wszystko kosztem dłuższego czasu wykonania preparatów balsamowych, no i kontaktu z paskudnym ksylenem.
Nie wiem na ile przydatny będzie ten przydługi opis dla innych, nieważne motylarzy, czy chrząszczarzy. Piszę go, nie ukrywam, że trochę sprowokowany przez perfekcjonizm Grzegorza, by pokazać, że niekoniecznie musimy aż tak bardzo przejmować się recepturami, stężeniami i traktować tego całego preparowania jak jakąś magię. Zwłaszcza gdy potrzebujemy tego tylko do oznaczenia gatunku, a nie do jego opisania i opublikowania stosownych ilustracji, które faktycznie powinny być dopracowane. Dużo ważniejsze jest by wiedzieć, co jest czym w aparacie kopulacyjnym, co jest istotne i by tego nie uszkodzić podczas preparowania, niż to, czy go mocniej czy słabiej wybarwimy i czym, albo jakie są stężenia roztworów barwiących.